引 言
全人源抗體、人源化抗體、嵌合抗體和鼠源抗體分別占臨床使用的所有單克隆抗體（mAbs）的51%、34.7%、12.5%和2.8%。其中全人源單抗和人源化單抗已經(jīng)成為治療性抗體領域的主導模式。本文首先介紹抗體免疫原性，人源化技術，特別介紹了納米抗體的免疫原性和人源化技術，隨后介紹了目前生產(chǎn)單克隆抗體的主要技術—噬菌體展示技術。
圖1 治療性抗體發(fā)現(xiàn)方法（圖片來源：參考文獻2）
治療性抗體免疫原性
1 ? 單抗免疫原性
在臨床環(huán)境中使用單抗應具有幾個基本的生物物理特性，如高抗原結合活性、高穩(wěn)定性和低免疫原性等。
抗體免疫原性是指宿主免疫系統(tǒng)對這些治療劑的識別和反應程度。在使用抗體藥物的病人身上發(fā)現(xiàn)免疫原性時，往往也會發(fā)現(xiàn)抗藥抗體（ADA）。抗藥抗體可能會中和治療劑，降低藥物療效。重要的是，抗藥抗體可能會進一步引起從皮疹到全身炎癥反應的不良反應，這會影響抗體藥物在臨床上使用時的安全性和有效性。
免疫原性受到多種因素的影響，如藥物劑量、給藥策略(途徑和組合)、雜質(zhì)污染、抗體/抗原結合復合體產(chǎn)生的聚集體以及結構特征(序列變異和糖基化)。
人源化抗體的恒定區(qū)存在人源序列，在Fv中幾乎全是人源序列，只有CDR來自小鼠移植。人源化程度更高的抗體通常在臨床環(huán)境中具有更高的耐受性和更低的免疫原性。例如，Perpetua等人將人源化的抗CD52抗體與其親代小鼠進行了比較，證明人源化顯著降低了免疫原性。但人源化抗體保留了小鼠CDR，而CDR可能會被宿主免疫系統(tǒng)視為外來抗原，最終產(chǎn)生免疫原性。
全人源抗體的CDRs和框架是由人類免疫球蛋白基因譜庫推導而出的，因此理論上可以避免免疫原性。然而，幾種全人源抗體在給病人使用時還是會引起顯著的免疫反應。如Adalimumab(阿達木單抗)是一種人類IgG1，在部分患者(5%-89%)中給藥時，它可通過刺激抗獨特型抗體產(chǎn)生顯著的免疫反應。造成這些情況的原因之一是，人類抗體的Fv序列與人類生殖系存在差異。到目前為止，還沒有可以準確地分析抗體的免疫原性的方法。
2 ? 納米抗體免疫原性
VHH和VNAR具有許多理想的特性，但在作為治療劑使用時，非人源的VHH和VNAR可能會增加不必要的免疫反應發(fā)生的機會。
然而sdAbs的一些固有特征有利于降低在人體內(nèi)的免疫原性：
1
因體積較小納米抗體會減少潛在免疫原性表位的數(shù)量。
2
納米抗體不易形成高免疫原性聚集物
3
非半衰期延長的sdAbs具有快速血液清除能力
大多數(shù)VHHs與人類IGHV3家族基因產(chǎn)品的序列高度一致（在FR序列中一致性高達95%）與人源化鼠類VH域（如曲妥珠單抗）相當，預計產(chǎn)生免疫原性較低。
但由于鯊魚和人類之間的進化距離，來自鯊魚的VNARs與人類的VH和VL結構域在序列上幾乎沒有相同之處（總體上約為30%），因此可以預測它是所有sdAbs中免疫原性是最大的。
雖然VHHs的CDR1和CDR2環(huán)與人類抗體典型結構類似，但其較長的CDR3環(huán)可能具有人類沒有的構象。VHH CDRs和FRs的高水平體細胞超突變可能有助于減少它們與人類IGHV3基因產(chǎn)品的序列同源性。
免疫原性構象表位也可能是由sdAb結構的微妙變化形成的，這些微妙變化是由非經(jīng)典的二硫連接形成的。抗sdAb ADAs也可能比針對全尺寸常規(guī)IgG產(chǎn)生的ADAs更容易被中和，因為根據(jù)定義，它們必須針對可變結構域中的表位，包括形成抗原結合位點的區(qū)域。
截至2020年，至少開展了35項，涉及1000多名患者和健康志愿者的基于VHH的生物藥物的臨床試驗。
大多數(shù)試驗顯示，VHH與全人源或人源化IgG的免疫原性相當，沒有或只有極少的免疫原性。在一項用于乳腺癌PET/CT成像的68Ga標記的抗HER2單克隆抗體的I期試驗中，20名患者在一次注射后沒有出現(xiàn)ADA。ALX-0141（由兩個相同的抗RANKL人源性VHH和一個抗白蛋白人源性VHH組成的三聚體抗體）的I期研究顯示，在42名健康志愿者中，單次皮下注射后沒有發(fā)現(xiàn)ADA。
考慮到免疫原性的限制，人們對開發(fā)全人源的sdAbs（VHs或VLs）有很大興趣。自主的VHs/VLs并不作為人類抗體庫的一部分天然存在，而是必須使用各種技術進行合成設計。以噬菌體展示技術為代表的體外展示技術，一直是發(fā)現(xiàn)sdAbs的關鍵平臺。
人源化單抗的生產(chǎn)
1 ?人源化單抗開發(fā)進程
得益于鼠源單抗成本低廉、生產(chǎn)周期短等優(yōu)點，鼠單抗人源化已進行大規(guī)模實施。沒有經(jīng)過人源化的鼠源單抗在治療中有很多不足。如用鼠源單抗治療的患者會產(chǎn)生人抗鼠抗體(HAMA)反應。HAMA不僅會提升鼠源單抗清除率，還可能產(chǎn)生過敏反應。此外，患者對小鼠片段結晶區(qū)(Fc)的反應激發(fā)抗體依賴性細胞毒性(ADCC)的能力有限。而人源化單抗能在有效發(fā)揮效應功能的同時，降低鼠源抗體的免疫原性。
只有輕鏈和重鏈來自小鼠CDR的人源化單抗于1988年首次進入臨床開發(fā)。CDR移植是生產(chǎn)人源化單抗最流行的技術之一。利用這項技術，非人類CDR序列能被移植到人類序列框架中，從而讓抗體保持與目標抗原的結合活性。1997年，F(xiàn)DA批準了第一個CDR嫁接的人源化單抗Daclizumab，它能與IL-2受體結合，用于防止移植排斥反應。在開發(fā)daclizumab中，不僅進行了CDR移植，而且還利用了與鼠源框架區(qū)同源性最大的人類框架，以減少抗原識別過程的損失。
在某些情況下，小鼠框架中的某些特定氨基酸對維持抗體結合活性至關重要。這些殘基可以與CDRs協(xié)同呈現(xiàn)抗體副表位，或直接與抗原反應。目前，這些關鍵的骨架殘基可以通過X射線結晶學、冷凍電子顯微鏡和計算機輔助蛋白質(zhì)同源模擬觀察抗體復合體的結構來鑒定，然后可以考慮在CDR嫁接的人源化抗體中通過‘human back to mouse'突變來恢復框架中的氨基酸位置，從而提高最終產(chǎn)物的親和力和穩(wěn)定性。
已經(jīng)開發(fā)了多種方法來量化mAbs可變區(qū)的人源化程度。如Abhinandan和Martin設計了一種名為H-Score的工具來評估抗體序列的人源化程度，該工具計算了與人類可變區(qū)序列數(shù)據(jù)庫的子集相比平均序列的同一性。
人源化抗體的使用極大地提高了單抗療法的臨床耐受性。這種對抗體序列的復雜控制能力為工程單抗在醫(yī)學上廣泛應用提供了可能。目前，用于治療人類的單抗中有一半是嵌合或人源化的(圖2)。
圖2 小鼠抗體（綠色結構域）到全人源抗體（橙色結構域）以及相關抗體人源化的示意性概述。a 鼠源單克隆抗體。b 嵌合單克隆抗體：可變區(qū)是小鼠來源，其余鏈是人源。CH：重鏈恒定區(qū)；CL：輕鏈恒定區(qū)；Fab和Fc：蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生的片段；VH：重可變區(qū)；VL：輕鏈可變區(qū)（圖片來源：參考文獻1）
用于治療人表皮生長因子受體2(HER2)陽性的轉移性乳腺癌和胃食道交界腺癌的曲妥珠單抗(Herceptin)是最著名的人源化抗體之一，該藥于1998年獲得批準，2018年實現(xiàn)了超過70億美元的年銷售額。
2 ? 利用噬菌體展示技術制備人源抗體
噬菌體展示技術是最早也是應用最廣泛的體外抗體篩選技術。噬菌體展示技術最初由George
P. Smith在1985年發(fā)明。Smith G
P第一次將外源基基因插入絲狀噬菌體f1的基因Ⅲ，使目的基因編碼的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌體表面，從而創(chuàng)建了噬菌體展示技術。噬菌體展示的抗體庫已被證明是鑒定有效的、完全人源性單抗的可靠發(fā)現(xiàn)平臺。
從噬菌體展示文庫中識別單抗的過程始于抗體庫的構建(圖3A)。
圖3 噬菌體展示抗體庫構建和親和力選擇 a 構建噬菌體顯示抗體（Fab或scFv）庫的程序概要。b IgG分子的結構。Fab由輕鏈和重鏈的前兩個結構域組成。scFv由可變重鏈（VH）和可變輕鏈（VL）結構域組成，由一個短的柔性多肽連接子連接。c 用噬菌體展示的庫進行生物篩選。噬菌體表面的初始抗體庫被用來固定固體表面抗原，如ELISA板或磁珠。非特異性的噬菌體通過嚴格的洗滌被去除（圖片來源：參考文獻2）
代表免疫球蛋白基因編碼庫的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)聚合酶鏈式反應(PCR)產(chǎn)物被連接到噬菌體展示載體中。人外周血單個核細胞(PBMCs)中的mRNA被逆轉錄成cDNA。然后使用特定的引物擴增不同的VH和VL鏈區(qū)基因，以擴增Ig譜系內(nèi)所有轉錄的可變區(qū)。
噬菌體展示文庫中抗體的形式可以是scFv或Fab片段(圖3B)，scFv由VH和VL結構域通過一個短的柔性連接子連接組成。展示在噬菌體外殼蛋白上的抗體Fab片段具有相對較高的結構穩(wěn)定性，并且可以很容易地轉化為完整的Ig抗體，通常不會損害結合活性。
噬菌體展示文庫的一大優(yōu)勢在于通過噬菌體顆粒將抗體表現(xiàn)型(特異性和敏感性)與基因型(遺傳信息)聯(lián)系起來。得益于噬菌體體積小和高溶解度(1013 particles/ml)，可在單個庫中有效產(chǎn)生和展示1011個獨立克隆的譜系大小。
噬菌體展示文庫的基因庫可以從天然或免疫的動物中獲得，或者可以使用隨機CDR序列在固定的框架內(nèi)來構建合成文庫。由于基因序列來自人類捐獻者的B細胞，因此天然庫相對接近人類抗體生殖系，免疫原性風險較低。
與天然庫相比，免疫庫的主要優(yōu)優(yōu)勢在于免疫庫中的抗體基因在體內(nèi)經(jīng)歷了親和力成熟，從而能夠開發(fā)出針對靶點的高親和力抗體。然而，這種方法要求目標抗原能夠成功地誘導免疫原性反應，并且必須為每個新的靶點準備新的文庫。
大容量天然文庫和合成庫能產(chǎn)生了針對廣泛靶點的高親和力抗體(亞納摩爾范圍)。因此，非免疫文庫具有明顯的優(yōu)點，避免了免疫小鼠出現(xiàn)的免疫耐受問題，而且它們不需要為每個新的靶點都建立新的免疫文庫。目前，幾乎所有商業(yè)文庫都基于高度多樣化的非免疫庫，這些庫能選擇能靶向大范圍靶點的抗體。
行業(yè)前瞻：納米抗體人源化
1 ? 納米抗體特性有利人源化
單域抗體（sdAbs）是駱駝和鯊魚重鏈抗體的可變區(qū)，作為生物藥物的組成部分，具有許多理想的特性。然而，它們的序列可能會增加人類的免疫原性和抗藥抗體（ADA）的風險，因此，sdAbs在開發(fā)時通常會進行人源化。
圖4 傳統(tǒng)脊椎動物四聚體Ig G1、僅駱駝重鏈Ig G和鯊魚Ig NAR的結構域?？贵w分子的可變區(qū)用黃色表示，抗原結合部位用紅色方框表示。（圖片來源：參考文獻1）
sdAb的一些特性，包括駱駝科動物的VHHs與人類IGHV3基因具有高同源性，有利于人類的低免疫原性，大多數(shù)臨床試驗表明sdAb的免疫原性很小，但單純的非人類序列并不能充分解釋sdAb的免疫原性，因為一些駱駝科動物的VHHs是無免疫原性的，而一些全人源的VHHs卻能引起ADA。
sdAb人源化會減少還是促進免疫原性仍不清楚。將通過進一步研究確定VHH和VNAR人源化的閾值，以在避免因聚集或穩(wěn)定性降低而導致結合親和力與免疫原性損失的同時，最大限度地提高人源序列含量。
2 ? 納米抗體人源化方法
已有不少研究人員嘗試人源化納米抗體。Vincke等人撰寫了第一份描述VHHs人源化的詳細報告。他們選擇NbHuL6（一種對人類溶菌酶有特異性的VHH）和NbBcII10（一種對蠟樣芽孢桿菌的BcII布拉氏菌酶的強效VHH抑制劑），作為人源化的測試案例。
圖5 降低sdAbs免疫原性的主要策略。i:駱駝VHH和鯊魚VHAR可以通過使用同源的人類可變區(qū)作為參考進行表面重塑（resurfacing)。ii:VHH/VNAR也可以通過將其CDR嫁接到合適的受體支架上來人源化(要么是先前人源化的VHH/VNAR，要么是全人VH然后反向突變)。人源化的替代方法包括使用噬菌體展示文庫技術和轉基因小鼠/大鼠，轉基因小鼠/大鼠產(chǎn)生滅活的內(nèi)源性抗體，敲入包含自主VH、D和JH基因片段的IgH基因片段，以及缺乏CH1外顯子的恒定區(qū)基因。（圖片來源：參考文獻1）
作者基于實驗結果提出了兩種生成具有最佳穩(wěn)定性和親和力的人源化VHHs策略。首先是將CDR移植到 “通用 ”人源化VHH支架上，即h-NbBcII10FGLA，這通常會產(chǎn)生具有良好表達能力、高穩(wěn)定性和可溶性以及保留親和力和特異性的人源化VHHs。如果這種策略導致了親和力損失，可以采用第二種重塑方法，即人源化第49和50位，但不改變第42和52位。（注：IMGT positions 42、49、50和52是四個關鍵的FR2增溶殘基位置）。
基于Vincke等人的Protocol，Ben Abderrazek團隊、Kazemi-Lomedasht團隊、Rossotti團隊、Yu、Li等團隊都對VHH人源化進行了有益嘗試，皆取得了不同程度的結果發(fā)現(xiàn)。
總而言之，sdAb人源化進程復雜程度各異，成功率難以預估，所以目前已經(jīng)開發(fā)了一些策略來規(guī)避人源化。這些技術主要分為三類：
(a)使用人源化或完全人源化的sdAb支架構建合成sdAb庫。
(b)將VHH和具有VHH序列特征的稀有分子分離。
(c)利用轉基因動物產(chǎn)生具有完全人類可變結構域的HCAbs。
結 語
噬菌體展示技術已被證明是產(chǎn)生全人源抗體的可靠方法。大容量（>1010）、高質(zhì)量（抗體多樣性豐富）的噬菌體抗體庫對成功識別治療性mAbs至關重要。此外，從噬菌體展示庫中的最佳選擇取決于目標抗原的質(zhì)量、抗原的固定化以及對結合和洗滌條件的嚴格控制。目前，已有9種從噬菌體庫中發(fā)現(xiàn)的全人類抗體被批準用于治療，還有幾十種噬菌體衍生的抗體治療藥物正在進行臨床試驗，等待進入市場。
而針對納米抗體人源化，還需要做更多的工作來確定VHHs和VNARs人源化的最佳策略，以便在不影響親和力、穩(wěn)定性或溶解性的情況下，最大限度地提高人源序列的含量，因為這些參數(shù)的細微變化可能對免疫原性產(chǎn)生不可預測的影響。
參考文獻：
1.Rossotti MA, Bélanger K, Henry KA, Tanha J. Immunogenicity and humanization of single-domain antibodies. FEBS J. 2022 Jul;289(14):4304-4327. doi: 10.1111/febs.15809. Epub 2021 Mar 25. PMID: 33751827.
2.Lu RM, Hwang YC, Liu IJ, Lee CC, Tsai HZ, Li HJ, Wu HC. Development of therapeutic antibodies for the treatment of diseases. J Biomed Sci. 2020 Jan 2;27(1):1. doi: 10.1186/s12929-019-0592-z. PMID: 31894001; PMCID: PMC6939334.
