近年來，CAR-T細(xì)胞療法獲得成功，卻難以在實(shí)體瘤治療中有顯著效果，鑒于此，用自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞)替代T細(xì)胞，即CAR-NK細(xì)胞療法，可能是一種更好的替代方案，而且有可能成為“現(xiàn)成”產(chǎn)品。NK細(xì)胞是機(jī)體的第一道防線，其具有抗體依賴的細(xì)胞毒性(ADCC)作用能自發(fā)殺傷腫瘤細(xì)胞和病原體，并參與機(jī)體的抗腫瘤免疫監(jiān)視和免疫應(yīng)答。本文綜述了CAR-NK細(xì)胞的產(chǎn)生、抗腫瘤活性的機(jī)制、優(yōu)勢(shì)及臨床試驗(yàn)，主要分析了CAR-NK細(xì)胞在實(shí)體瘤治療面臨的挑戰(zhàn)及相應(yīng)策略。
具有CAR結(jié)構(gòu)的NK細(xì)胞的基因工程也類似于CAR-T細(xì)胞的生成。癌癥患者采用CAR-NK療法的程序如圖1所示。
一、CAR-NK細(xì)胞的介紹
NK細(xì)胞因?yàn)槠淇乖?dú)立，對(duì)顯示特定表面特征的細(xì)胞具有強(qiáng)大的細(xì)胞溶解活性，獨(dú)特的生物學(xué)特性、抗腫瘤機(jī)制、來源廣泛、安全性高等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是一種很有前途的CAR-T替代品。目前有不少于40項(xiàng)臨床試驗(yàn)在實(shí)體瘤患者中調(diào)查過繼輸注NK細(xì)胞(通常與其他治療方式相結(jié)合)的安全性和有效性 。
圖 1 用于癌癥患者過繼轉(zhuǎn)移免疫治療的CAR-NK細(xì)胞產(chǎn)生過程
CAR-T療法在臨床試驗(yàn)中的成功促進(jìn)了CAR-NK細(xì)胞的發(fā)展。具有CAR結(jié)構(gòu)的NK細(xì)胞的基因工程也類似于CAR-T細(xì)胞的生成。癌癥患者采用CAR-NK療法的程序如圖1所示。
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CAR-NK細(xì)胞的產(chǎn)生
CAR-NK細(xì)胞采用T細(xì)胞設(shè)計(jì)的前四代CAR結(jié)構(gòu)，由胞外抗原結(jié)合區(qū)(scFv)、胞外鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)以及胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)域組成，現(xiàn)在又結(jié)合NK細(xì)胞的特異性區(qū)域，使其具有更強(qiáng)的NK細(xì)胞激活和抗腫瘤反應(yīng)，CD28和4-1BB是兩個(gè)常用的經(jīng)典共刺激結(jié)構(gòu)域。
目前臨床上使用的NK細(xì)胞主要有五種來源：人外周血（PB）、臍帶血（UCB）、人胚胎干細(xì)胞（hESCs）、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）以及NK-92細(xì)胞系。將CAR基因?qū)隢K細(xì)胞的途徑可分為病毒途徑和非病毒途徑(圖2)。病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)是CAR-NK轉(zhuǎn)導(dǎo)使用的主要方法，常用的病毒載體有：狒狒包膜糖蛋白(BaEV-GP)，重組腺相關(guān)病毒(AAV)，CD19-CAR慢病毒等等。非病毒途徑常用mRNA電穿孔法。
圖2 將CAR導(dǎo)入NK細(xì)胞的多種途徑。介紹了病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)(上)和非病毒電穿孔(下)兩種NK細(xì)胞基因工程方法及其優(yōu)缺點(diǎn)
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癌癥致死機(jī)制
NK細(xì)胞具有細(xì)胞毒性和免疫調(diào)節(jié)雙重功能，具有強(qiáng)力殺傷腫瘤細(xì)胞的能力，且不具主要組織相容性復(fù)合體（MHC）限制性，當(dāng)NK細(xì)胞接觸到MHC分子下調(diào)的腫瘤細(xì)胞時(shí)，由于抑制信號(hào)的缺失可引起NK細(xì)胞對(duì)腫瘤的殺傷，同時(shí)，當(dāng)某些腫瘤細(xì)胞激活信號(hào)的上調(diào)也會(huì)引起NK細(xì)胞的激活和對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷。
NK細(xì)胞可以通過CAR結(jié)構(gòu)的基因工程靶向殺傷腫瘤（圖1B)。對(duì)于實(shí)體瘤，抗Her2和抗EGFR工程N(yùn)K治療已在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、乳腺癌和卵巢癌等幾種癌癥中得到報(bào)道，其他抗原包括間皮素，PSCA, GPA7和EpCAM也可作為實(shí)體瘤CAR-NK細(xì)胞靶點(diǎn)。
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CAR-NK細(xì)胞獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)與缺點(diǎn)
與CAR-T相比，NK細(xì)胞來源豐富，且CAR-NK具有更好的安全性和多種可用的細(xì)胞毒性機(jī)制，但也有很多缺點(diǎn)阻礙了其推廣。詳見表3
表 3 CAR-T療法與CAR-NK療法的優(yōu)缺點(diǎn)比較
二、CAR-NK在實(shí)體瘤治療的障礙及應(yīng)對(duì)策略
臨床結(jié)果表明，過繼轉(zhuǎn)移（ACT）的NK細(xì)胞在實(shí)體瘤治療中必須滿足：(1) 進(jìn)入并充分滲透腫瘤微環(huán)境； (2) 較長(zhǎng)持久性和增殖能力（3）調(diào)節(jié)強(qiáng)大的分泌和細(xì)胞毒功能。
（1）NK細(xì)胞的擴(kuò)增和純化
ACT需要大量具有高細(xì)胞毒性的NK細(xì)胞，但其在外周血淋巴細(xì)胞中所占比例不超過10-15%，需要體外培養(yǎng)擴(kuò)增。將表達(dá)白介素15（IL-15)和黏附分子4-1BBL的K562飼養(yǎng)細(xì)胞與外周血自然殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)是一種較好的方法，一項(xiàng)用含有IL-2、IL-21的GMP兼容培養(yǎng)液和照射的自體飼養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行的手動(dòng)實(shí)驗(yàn)有效地誘導(dǎo)了85倍的NK細(xì)胞擴(kuò)增。
同種異體NK細(xì)胞可能被T細(xì)胞污染，從而影響NK細(xì)胞的治療。研究發(fā)現(xiàn)，在第一次過繼轉(zhuǎn)移IL-15/4-1BBL激活的NK細(xì)胞(aNK)的人體試驗(yàn)中，aNK-DLI可能通過增強(qiáng)潛在的T細(xì)胞同種異體反應(yīng)而導(dǎo)致急性GVHD。前體淋巴細(xì)胞缺失可能有助于純化NK細(xì)胞。
（2） CAR-NK細(xì)胞在體內(nèi)的持久性
NK細(xì)胞不會(huì)大量擴(kuò)增，在體內(nèi)的壽命很有限，導(dǎo)致其持久性差。細(xì)胞因子如IL-2和IL-15是參與NK細(xì)胞功能的關(guān)鍵分子。IL-15在體外可刺激NK細(xì)胞增殖，上調(diào)NK細(xì)胞表面活化受體NKp30的表達(dá)。ALT-803在體內(nèi)可以促進(jìn)CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞的增殖，且患者對(duì)它的耐受性很好。
（3）TME的抑制
NK細(xì)胞運(yùn)輸受損以及具有免疫抑制作用的代謝TME特征會(huì)阻止ACT NK細(xì)胞進(jìn)入實(shí)體瘤的TME中，限制其持久性或抑制其細(xì)胞毒功能(圖3)。
圖 3 實(shí)體瘤中最佳NK細(xì)胞活性的環(huán)境障礙
（4）抗NK細(xì)胞活性的免疫和基質(zhì)屏障
TME的許多免疫和基質(zhì)細(xì)胞隔膜有效地抑制了NK細(xì)胞的效應(yīng)功能，因此，靶向這些細(xì)胞群，如Treg細(xì)胞、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）、MDSCs和癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAF)，可以賦予腫瘤浸潤(rùn)性NK細(xì)胞優(yōu)越的效應(yīng)功能（圖4）。
圖 4 實(shí)體瘤中免疫和基質(zhì)屏障對(duì)最佳NK細(xì)胞活性的影響
（5） “現(xiàn)成”CAR-NK細(xì)胞的儲(chǔ)存、運(yùn)輸和回收
現(xiàn)成的CAR-NK細(xì)胞的儲(chǔ)存、運(yùn)輸和回收是促進(jìn)大規(guī)模臨床推廣所必需的，但NK細(xì)胞在解凍后，其存活率和細(xì)胞毒作用顯著下調(diào)，而用IL-2培養(yǎng)可以改善冷凍對(duì)NK細(xì)胞的影響。此外，細(xì)胞因子激活的NK細(xì)胞對(duì)低溫非常敏感，所以需要在體溫下運(yùn)輸。適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度在運(yùn)輸過程中至關(guān)重要，過高的細(xì)胞濃度可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞活性喪失。
結(jié) 語
目前，基于CAR-NK細(xì)胞的治療因其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和現(xiàn)成產(chǎn)品相對(duì)于CAR-T治療的可行性而成為一個(gè)熱門的研究領(lǐng)域，有望成為治療癌癥的一種替代細(xì)胞免疫療法，但NK細(xì)胞用于實(shí)體腫瘤的治療仍然受到許多障礙的阻礙，如何優(yōu)化NK細(xì)胞特異性CAR結(jié)構(gòu)的基因編輯技術(shù)，如何快速有效地?cái)U(kuò)增和激活NK細(xì)胞，以及如何提高TME的持久性和修復(fù)以提高實(shí)體瘤的治療效果等問題仍需繼續(xù)研究和解決。
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參考文獻(xiàn)：
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